对硫代寡核苷酸的分析同磷酸二酯寡核苷酸一样，随长度增加分辨率降低。但阴离子交换HPLC对寡核苷酸骨架上磷酸基的差异非常敏感，磷酸基未被硫代时，保留时间缩短，且同一寡核苷酸随未被硫代的磷酸基的个数增加，保留时间依次降低。
影响HPLC分离寡核苷酸的因素同制备一样，包括柱填料、洗脱液组成、色谱条件。在分离中使用变化较慢的梯度，可极大改善组分分离，但增加分析时间。HPLC对寡核苷酸的定量总是通过测量被测组分的峰高或峰面积进行的。分离度不好时，测量峰面积误差比测量峰高大。在相接近的准确度下，峰高测量对分离度的要求比峰面积低一些，但峰高定量只适于峰高随样品量线性变化的情况。当峰形畸变或者柱的样品量超负荷时，就不能使用峰高定量。用峰面积定量的好处是峰面积受操作条件变化影响较小，对于形状不好的峰，峰面积定量的结果比用峰高定量有所改善，但这个方法的准确度受相邻峰重叠的影响。
寡核苷酸定量测定时，可使用外标法，也可使用内标法。外标法适合于工业化生产的常规分析。内标法可以抵销仪器和过程带来的误差。也可使用内标物含量相同样品组分不同的溶液绘制标准校正曲线。
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