伪狂犬病病毒Ea株TK~-gE~-gp63~-突变株的构建及其生物学特性

/gp63突变株，生物学特性伪狂犬病病毒（，86114士8丨18，）属疱疼病毒科，具有在细胞培养物上快速生长、强烈的神经嗜性与潜伏感染性等特性。本病毒可感染多种家畜和野生动物，对养猪业的经济损失*大。伪狂犬病对养猪业的危害主要表现在：（1）母猪流产，产死胎、木乃伊胎，临床以产死胎为主。（2）新生仔猪大量死亡，15日龄以内仔猪死亡率为100%.（3）断奶仔猪发病死亡，表现为拉稀，作划水样或转运动，口吐白沫、阵挛性痉挛及强性痉挛和搔痒等症状。（4）引起种猪不育。公猪发生睾丸肿胀、萎缩，失去种用能力。母猪表现为不发情、返情、屡配不孕等。（5）育肥猪表现为慢性呼吸道症状、增重迟缓、饲料报酬降低、推迟上市的时间，少数病例出现神经症状死亡情况PRV基因组为线状双链DNA分子，大小约150kb.整个基因组由独特长区UL独特短区US及位于US两侧的末端重复序列TR和内部重复序列IR构成PRV整个基因组至少含有70个基因，可编码70~100种蛋白质，其中毒力基因一直是PRV的研宄热点之一。随着PRV分子生物学的深入开展，胸苷激酶TK核糖核苷酸还原酶RR.蛋白激酶PK和蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶ST碱性核酶外切酶ANll.脱氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）12等酶类基因，gp63、gE、gC等糖蛋白基因均是PRV重要的毒力基因13.近年来研宄也表明，其它基因如gM.UI21等也与PRV毒力有关。gp63.gE可形成二价复合体，二者的缺失可大大降低毒力。糖蛋白基因如gEgGgC缺失后，疫苗免疫猪不产生针对所缺失糖白的抗体，结合ELSIA和乳胶凝集试验（LatexAgglutinationTestLAT）16可区分疫苗免疫猪和野毒感染猪，从而淘汰野毒感染猪，世界许多国家正是比此原理制定伪狂犬病的根除计划，目前宣布根除伪狂犬病的国家有英国。

芬兰。瑞典。捷克共和国等。在我国，2000年全国伪狂犬病普查结果表明，30%以上猪场有伪狂犬病感染发病，给养猪业造成巨大的损失。因此，制定我国的伪狂犬病根除计划己提上了日程，本研宄以伪狂犬病地方分离株PRVEa株为材料构建的TK缺失株，构建了PRVEaTK/gE/LacZ+突变株。在此基础上，又构建了PRVEaTK/gE/gp63突变株，并通过运动试验对其生物学特性进行了研宄。

1材料和方法1.1试验材料111质粒、病毒、细胞、细菌：质粒卩8私译证丑。0184由本室构建，其中译证丑为8，根据根据GenBankAF306511和AF171937收录的gE、gp63序列设计g/E13.2转移质粒pFBBS的构建：用StuI和BstElI双酶切质粒pSKFB用去磷酸化T4DNA连接酶连接，转化E.co/iDH5a感受态细胞，以质粒小量制备法提取质粒，一20*C贮存备用。

/LacZ+突变株的构建：用脂质体法将PRVEaTK*基因组与pSPFZ共转染PK-15细胞，蓝斑筛选和空斑纯化参照进行，空斑纯化三次后，PCR扩增TK基因和LacZ基因，提取重组病毒基因组，一20*C保存备用。

将酶切产物与质粒pFBBS共转染PK-15细胞，空斑纯化三次后，PCR扩增gE/gp63基因，提取重组病毒基因组一20C保存。

13.5测序质粒的构建及序列分析：以PRVEaTK/gp63*为模板，扩增gE用DNA回收试剂盒回收后，用T4DNA连接酶连接入pMD18-T载体提取重组质粒，以双脱氧末端终止法测序。

细胞致死量（TCID.，并取2倍原液（200L），原液（lOWL），10倍稀释（10（M），100倍稀释（100凡）接种Balb/C小鼠，每组6只，逐日观察2周。Balb/C小鼠分组如表1采用后肢足垫注射，接种病毒后观察2周。

表1Balb/C小鼠接种试验注射剂量2实验结果1重组质粒pFBBS的构建用StuI和BstElI双酶切质粒pSKFB去掉大小约1247bp的片断；该质粒成为缺失部分gE部分gp63，及二者中间区域共1247bp的gE*/gp63转移质粒。

将PRVEaTK*基因组与质粒pSPFZ共转染PK-15细胞，蓝斑筛选和空斑纯化，PCR扩增出TK、LacZ图略，这表明LacZ插入PRVEaTK*基因组中。

的PRVE基因组作对照，在琼脂糖凝胶上电泳，图略。酶切后的基因组分为二部分，而未酶切的基因组仅一条带，进一步证实LacZ基因整合入PRVEa基因组中。

/LacZ+基因组用EcoRl酶切后，与质粒pFBBS共转染PK-15细胞，空斑纯化三次后用4对引物分别扩/gp63*，gE如从中可以扩出TK*基因748bp的片断和gE/gp63基因500bp的片断；不能扩出gE基因804bp的片断和LacZ基因433bp的片断，表明该毒株为LacZ己被置换掉，gE/gp63己经缺失的突变株。

25序列分析扩增gE*/gp63*的产物连入T载体重组质粒，双脱氧末端终止法测序，结果如。将其与GenBankAF306511和AF171937收录的gE、gp63序列相比较，gE和gp63基因及二者间隔序列共缺失了1247bp.26突变株毒力试验3期刘正飞等：伪狂犬病病毒Ea株！K*/gE/gp63*突变株的构建及其生物学特性研究373PRVEa株gp63和gE缺失后剩余序列TK一/gE*/gp63*PRVEaTK*/gE*LacZ+均没有死亡情况出现，而PRVEa组全部死亡。这表明该突变株毒力大大下降。

3讨论表2接种病毒后Balb/C死亡情况TK、gE、gp63均是PRV重要的毒力基因，人们将TK基因缺失，获得**代基因缺失疫苗。在此基础上，缺失gE、gp63等基因，获得第二代基因缺失疫苗。本文在PRVEaTK株gE基因中引入LacZ基因，既可使gE基因插入失活，又可以在该病毒基因组中引入EcoRl位点。用EcoRl酶切PRVEaTK一/gE一/LacZ+基因组，再与质粒pFBBS共转染PK-15细胞，从而获/gp63*三基因缺失突变性。

由于PRV基因组庞大（150kb），非必需基因和不编码区较多，在这些区域引入其它病毒的基因如HCV-E1、JEV-NS1、PPV-VP2、PRRSV-VP5等，构成二价基因工程疫苗，疫苗接种猪可同时抵抗多种病原的侵袭，PRV中引入LacZ对PRV本身的生物特性的影响及在临床上是否具有负作用，还须深入观察。因此，去除LacZ基因，从根本上缺失gE和gP63基因，是十分必要的。研究表明TK为PRV对病毒在中枢神经增殖是十分必要的；在细胞上TK缺失的病毒与野毒一样能增殖良好。gp63、gE致病机理为二者形成复合体，侵入二级神经元。gp63和gE缺失后，PRV不能侵入二级神经元，因此，gp63、gE及TK缺失后PRV毒力大大降低，这从Balb/C小鼠试验可以证实。目前我们正准备将该突变株接种兔、狗、猫、猪等动物，进行安全性和保护力试验以期将之作为基因工程弱毒苗在临床上使用。

在PRV的各种糖蛋白中，gB、gC、gD是PRV的主要免疫原，诱导宿主产生中和抗体。gB、gC、gD缺失后，尽管敏感性更高，但PRV的免疫原降低；而gE、gp63既非体液免疫主要靶蛋白又非细胞免疫的主要靶蛋因而缺失gE和gp63不会降低疫苗的保护力何启盖，陈焕春，邱德新，等。中国兽医科技，199929（1）：79.陈焕春，方六荣，何启盖，等。畜牧兽医学报，199829（3）：156161.陈焕春，周复春，方六荣，等。病毒学报，200117（1）：6974方六荣，周复春，陈焕春，等。畜牧兽医学报，200132（）244248.