应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒基因周艳君，仇华吉，王云峰，钱平，蔡雪晖，柴文君，翁长江，童光志（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨150001）DNA）共转染昆虫细胞sf9，经过三轮蚀斑纯化后，获得重组杆状病毒rBac_GP5.用该重组病毒感染sf9细胞后，应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明，GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达，表达产物因糖基化程度差异，表观分子量有22、25和30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的26.4.

传染病，表现为妊娠母猪繁殖障碍（流产、早产、死胎和木乃伊胎），仔猪死亡率升高，各种年龄猪发生呼吸道疾病，是目前威胁养猪业健康发展的重要传染病之一。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），是有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大小为15kb，含有8个开放阅读框架（ORFPRRSV与马动脉炎病毒（EAV）、猴出血热病毒（SHFV）以及鼠乳酸脱氢酶升高症病毒（LDV）同归属于新成立的动脉炎病毒科、动脉炎病毒属PRRSV有6种结构蛋白和2种非结构蛋白，其＊通讯作者中，由ORF5编码的糖基化囊膜蛋白（GP5或E蛋白）是该病毒的主要结构蛋白之一，但对该蛋白的结构与功能并不十分清楚。*近有研究表明，该蛋白具有6个抗原决定簇，其中有一个是血清型特异性线性中和决定簇，能在体外中和病毒的感染性，病毒中和作用与GP5抗体的效价呈显著的相关性Plana等用杆状病毒对GP5基因进行了表达，表达产物分子量根据糖基化程度不同有17、20、23、25。由于表达产物以非融合蛋白形式，不利于分离纯化。为了进一步研究该蛋白的结构与功能，同时为了便于表达产物的纯化和结晶，本文利用杆状病毒表达系统以融合蛋白形式表达了我国首次分离的PRRSVCH_la株的GP5基因。

1材料和方法1.1毒株与质粒PRRSVCH_la株分离自北京某猪场，已证明属于北美洲型PRRSVCH_la株GP5基因的重组质粒，由本研究小组构建，杆状病毒转移载体pBlueBacHisB购自Invit1.2主要试剂各种限制性内切酶及修饰酶购自转染试剂盒为Invitrogen公司产品。

1.3重组转移载体质粒的构建将质粒pUC18_ORF5用限制性内切酶EcoRI消化，补平后，再用PstI进行酶切，回收638bp的目的片段。同时将pBlueBacHisB质粒经BamHI酶切后补平，用PstI消化，然后回收约10kb的目的片段。按常规方法进行连接、转化。获得的重组质粒经PstI酶切、PCR鉴定（用ORF5特异性引物P5S/P5R和转染试剂盒提供的通用引物Bac1/Bac2）和序列测定后，证实得到了含PRRSVCH_la株GP5基因完整阅读框架的重组转移载体质粒。

1.4转染及重组病毒的筛选转染程序按Invitrogen公司转染试剂盒说明书进行。X_gal作为指示剂，进行三轮蚀斑纯化后，获得了重组杆状病毒，命1.5重组病毒的PCR鉴定应用通用引物Bac1/Bac2，进行PCR扩增，循环参数按照转染试剂盒说明书进行。

1.6重组杆状病毒GP5基因的表达及检测用纯化的重组病毒感染sf9细胞，感染后96小时收获细胞，制成细胞涂片，以冷丙酮固定，用PRRS多克隆血清进行间接免疫荧光检测。同时取感染后24～96小时的sf9细胞进行SDS_PAGE分析，并用PRRS多克隆血清进行Westernblot分析。

2结果2.1重组杆状病毒转移载体的构建目的片段与载体经酶切处理，连接、转化后，所得重组转移载体经PstI酶切鉴定，以及根据北美洲VR_2332株设计的特异性引物P5S/P5R和杆状病毒转移载体通用引物Bac1/Bac2进行PCR鉴定，其结果与预期结果均一致（图1～3）。

2.重组转移载体质粒recombinant4.空白对照（H2.2重组杆状病毒的筛选及纯化将pBlueBacHisB_ORF5与线形杆状病毒DNA共转染sf9细胞，3天后，每天观察转染的细胞。以出现细胞病变但无多角体形成的为重组病毒，经三轮蚀斑纯化后获得了阳性重组杆状病毒。

2.3重组杆状病毒的PCR鉴定以重组杆状病毒DNA为模板，利用杆状病毒通用引物Bac1/Bac2进行PCR扩增，同时设立以转移载体pBlueBacHisB_ORF5为阳性对照，结果得到了约1.3kb的片段，与阳性对照大小一致。表明PRRSV的ORF5基因已经重组于杆状病毒的基因组中（图4）。

用经重组病毒感染96小时的sf9细胞进行间接免疫荧光试验，结果发现与细胞对照相比，被感染的细胞周围呈现亮绿色的荧光，而细胞对照则呈现明显的暗红色。通过对重组病毒感染不同时间的sf9细GP5基因重组病毒在sf9细胞中获得了表达，其表达的融合蛋白分子量大小分别为22kDa、25kDa、30kDa，表达产物经薄层扫描测得其含量总计约占细胞蛋白1.感染96小时sf9细胞2.感染72小时sf9细胞3.sf9细胞对照4.蛋白分子量标准3讨论本文利用杆状病毒系统以融合蛋白的形式成功blot分析与间接免疫荧光试验，证明用杆状病毒所表达的E蛋白与天然的E蛋白同样均能被PRRSV高免血清所识别。由于所获得的重组融合蛋白带有35个组氨酸残基（分子量约为5kDa），分子量大小分杆状病毒表达的非融合型E蛋白分别正好相差其糖基化程度不同，故分子量大小也不一致，其中样属于非糖基化形式，而30kDa与25kDa则属于完全糖基化形式。另外，我们利用杆状病毒表达系统所表达融合蛋白总含量约占细胞中蛋白含量的26.4，远远高于Plana等报道的结果，可能与转移载体或培养条件有关。

目前在真核表达系统中，杆状病毒表达系统以其高效忠实的表达而得到了广泛应用。近几年来，随着杆状病毒转移载体的进一步改造，使得其转染效率得到了很大的提高。本研究所采用的转移载体引入了LacZ报告基因，使重组病毒的筛选工作变得更加简便，大大提高了工作效率。更为重要的是，表达产物系含有多聚组氨酸标签（tag）的融合蛋白形式，可以利用商品化亲和层析柱进行分离纯化，大大方便了表达蛋白的后加工处理，有利于大量制备或生产。

随着我国养猪业的集约化发展，PRRS逐渐成为一大隐患。现在虽然已有商品化的灭活疫苗和弱毒疫苗问世，但其免疫效力和安全性不尽人意，有些疫苗在使用中引起很大的争议，因此有必要研制免疫效力高、安全性好的新型疫苗。本研究应用杆状病毒系统表达了PRRSVGP5基因，为PRRS亚单位疫苗的研制开辟了一条途径，同时也为进一步研究病毒结构蛋白的功能奠定了基础。

中国预防兽医学报2000年一株鸡大肠杆菌型及型菌毛蛋白结构基因的克隆戴鼎震1，汤厚宽1，郑明球2，蔡宝祥2，陈溥言（1.湖北农学院动物科学系，荆州4332.南京农业大学动物医学院，南京095）papA保守区的2对引物。经PCR从1株带有甘露糖敏感血凝特性（MSHA）及甘露糖抵抗血凝特性（MRHA）的鸡致病性大肠杆菌（HJ20e）染色体中扩增到大小分别在657bp及541bp的2种阳性产物。通过核酸序列测定分别确证所扩增的DNA片段分别为pilA及papA基因。经酶切、连接、转化和筛选，得到pilA及papA基因的阳性克隆。

鸡大肠杆菌有二类菌毛，即1型及P型菌毛，二者均由染色体编码。1型菌毛可对鸡呼吸道上皮细胞起粘附作用，有利于细菌在宿主体内定居、繁殖[2，3].它由piA及相关基因簇编码。绝大多数鸡致病性大肠杆菌均可表达1型菌毛。1型菌毛能介导菌体对很多动物的红细胞、酵母细胞及很多其它类型的细胞的特异性粘附，但这种粘附作用可被D_甘露糖所抑制。由于这一特性，1型菌毛又被称为甘露糖敏感血凝特性（MSHA）菌毛。P型菌毛则是由pap及相关基因簇编码，多与人、狗及猪尿道大肠杆菌感染有密切关系[4，5].P菌毛也能凝集红细胞，但只有O型血的人的红细胞才能使P型菌毛表现出良好的血凝特性。因其血凝作用不能为甘露糖所抑制，故又被称为甘露糖抵抗血凝特性（MRHA）菌毛。P菌毛被认为不能直接粘附鸡气管粘膜上皮，但对鸡大肠杆菌病的进一步发展起重要作用。1型菌毛及P菌毛已被认为大肠杆菌重要的毒力因子[1，3].有的细菌可同时具备1型菌毛及P菌毛由于菌毛是一种蛋白质，故有人将其制成菌毛亚单位疫苗，免疫鸡后发现具有非常好的保护效果单根菌毛是由1000多个由pilA或papA基因编码的菌毛蛋白亚单位相互缠绕组装而成。国内外尚未报道从同一株鸡大肠杆菌中同时克隆到1型菌毛及P菌毛蛋白结构基因。仅有从人大肠杆菌中同时克隆到1型及P型菌毛结构基因的报道。研究发现，人源与鸡源大肠杆菌之间的1型及P型菌毛蛋白具有同源性[2，8].本研究拟以人大肠杆菌菌毛结构基因DNA序列为模板，在其同源区设计引物，运用PCR技术从鸡大肠杆菌染色体样品中同时扩增和克隆1型及P型菌毛结构基因，并测定其核酸序[6]郭宝清，陈章水，刘文兴，等。中国畜禽传染病，1996，2：1～4.

[7]仇华吉，郭宝清，童光志，等。中国兽医学报，1998，18（2）：～121.