HPTLC与HPLC分离的机理是相同的。不同长度的寡核苷酸的Rf及斑点至原点（点样处）的距离Rd均与寡核苷酸的长度（碱基个数）成显著相关性，因此HPTLC可判断寡核苷酸的碱基个数。但不同碱基对Rf或Rd值的贡献不同，不同碱基组成的同一寡核苷酸Rf值也将不同，所以利用该法给出的寡核苷酸长度并不完全准确。该法分析寡核苷酸所用展开剂一般由正丙醇-水-浓氨水或异丙醇-水-浓氨水系统组成。丙醇浓度一般为45%～65%，水为25%～45%，浓氨水为5%～10%.异丙醇展开强度比正丙醇大，适用于分离较长的寡核苷酸，正丙醇则相反。降低氨水的浓度，样品Rf增大，但氨水浓度太低，样品分辨率将下降。对个别长度小于10～13的寡核苷酸，可用正丙醇系统并增加正丙醇浓度至60%以上或用水及氨水（4∶1）饱和的正丙醇系统。使用外标法，HPTLC可定量测定寡核苷酸含量。HPTLC的定量测定具有操作简单、快速、微量，可同时测定多个样品、样品间无交叉污染等优点。
阴离子交换HPLC提供了很好的分离时间重现性和定量准确性，但对一些寡核苷酸不能给出单碱基分离。CGE能提供单碱基分离，但在每次分离中，电解液组成作为时间的函数而发生变化，*大迁移时间和重现性仅在每次分析使用新鲜电解质时获得。变性缓冲液的使用使其耐久性降低。HPTLC法重现性差和分析精度低。
以上的分析方法仅能确定寡核苷酸组分和纯度，对于长度、均一性、碱基组成、序列等结构特性必须用其他方法检测。质谱测定质量的高鉴别能力使它能够提供寡核苷酸的组成、序列、均一性等结构信息，而质谱定量仅是半定量的，所以寡核苷酸的分析常几种方法结合使用或将CGE，HPLC，HPTLC的强分离能力和质谱的高鉴别能力的优点结合在一起，形成联用技术。如HPLC-MS，HPTLC-MS等.
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